انواع و روش هاي کروماتوگرافي
يکي از پرکاربردترين روش هاي جداسازي مواد در آزمايشگاه کروماتوگرافي است و در مواقعي که جداسازي به روش هاي ديگر ناممکن است به راحتي مي توان از اين روش استفاده کرد

يکي از پرکاربردترين روش هاي جداسازي مواد در آزمايشگاه کروماتوگرافي است و در مواقعي که جداسازي به روش هاي ديگر ناممکن است به راحتي مي توان از اين روش استفاده کرد، زيرا اختلافات هاي جزئي موجود در رفتار اجسام باعث تسهيل جداسازي در جريان عبور آن ها از يک سيستم کروماتوگرافي مي شود . اين روش بسيار ساده و سريع است به طور مثال آزمايشي که ممکن است با استفاده از روش ستون تقطير چندين روز به طول بينجامد، مي تواند به کمککروماتوگرافي در عرض زماني بسيار کوتاه انجام گيرد، وسايل مورد لزوم آن نيز ارزان قيمت است. مزيت ديگر روش هاي کروماتوگرافي اين است که تنها مقدار بسيار کمي از مخلوط براي تجزيه لازم است به اين دليل روش هاي تجزيه اي مربوط به جداسازي مواد کروماتوگرافي مي توانند در مقياس ميکرو و نيمه ميکرو انجام گيرند.

کروماتوگرافي لغتي يوناني به معني رنگ نگاري است که ترکيبي از دو واژه "کروما" به معني رنگ و "گروفين" به معني نوشتن است. در سال ۱۹۰۳ براي اولين بار از اين روش جداسازي مواد رنگي استفاده شد که اين کار توسط ميخائيل سوئت انجام گرفت. اما امروزه از اين روش براي جداسازي مواد بي رنگ چون گازها استفاده مي شود. اساس کروماتوگرافي ، جذب سطحي مواد و توزيع آن ها در دو فاز است. در اين روش جداسازي بر اساس حرکت نسبي دو فاز صورت مي گيرد بدين ترتيب که يکي از فازها که فاز ساکن ناميده مي شود بدون حرکت است و فاز ديگر فاز متحرک نام دارد. با عبور دادن فاز متحرک از داخل فاز ساکن جرياني به وجود مي آيد، در اين حالت اجزاي مختلف نمونه سرعت هاي حرکت مختلف دارند و جداسازي بر اساس همين اختلاف سرعت ها انجام مي شود. فاز متحرک مي تواند گاز يا مايع و فاز ساکن مي تواند جامد يا مايع باشد.

لازم به ذکر است که به علت انرژي جنبشي بالاي مولکول هاي گازي، فاز ساکن را گاز قرار نمي دهند. اگر فاز ساکن جامد باشد، کروماتوگرافي جذب سطحي و اگر فاز ساکن مايع باشدکروماتوگرافي را تقسيمي مي نامند. نوع ديگري از نام گذاري روش هاي کروماتوگرافي بر اساس ماهيت فاز متحرک و ماهيت فاز ساکن انجام مي شود. که بدين ترتيب کروماتوگرافي به چهار بخش اصلي طبقه بندي مي شود. نامي که در ابتدا آورده مي شود بيان کننده ماهيت فاز متحرک و نام دوم بيان کننده ماهيت فاز ساکن است.

● کروماتوگرافي مايع – جامد (LSC)

در اين روش جدا شدن بر اساس جذب سطحي يا تشکيل کمپلکس است. کروماتوگرافي LSC در واقع نوعي کروماتوموگرافي جذبي است که مواد بر اساس اختلاف در قابليت جذب خود روي سطح جامد از يکديگر جدا مي شوند. اين روش نيز به انواع مختلفي چون کروماتوگرافي جذب سطحي (براي جداکردن مواد شيميايي غير مشابه) ، کروماتوگرافي لايه نازک، کروماتوگرافي تبادل يوني و کروماتوگرافي ژلي تقسيم مي شود.

● کروماتوگرافي گاز – جامد (GSC)

در اين روش نيز اساس جداسازي جذب سطحي فاز گاز روي سطح جامد است که براي خالص سازي گازها اجسام فرار استفاده مي شود.

● کروماتوگرافي مايع – مايع (LLC يا HPLC)

به دو گونه تقسيمي (براي جدا کردن مواد شيميايي مشابه) و کاغذي استفاده مي شود.

● کروماتوگرافي گاز مايع (GLC يا VPC)

کروماتوگرافي ستون مويين از اين نوع است. در LLC و GLC ، مواد بر اساس توزيع بين دو فاز جدا مي شوند. براي انتخاب نوع روش کروماتوگرافي ابتدا روش هاي ساده تر مانند کروماتوگرافيکاغذي و لايه نازک امتحان مي شوند و اگر پاسخ گو نباشد به سراغ روش هاي پيچيده تر مانندروش کروماتوگرافي مايع با کارايي بالا (HELC) مي رويم.

حال به توضيح برخي روش هاي کروماتوگرافي مي پردازيم:

▪ کروماتوگرافي جذب سطحي

در اين نوع کروماتوگرافي جداسازي بر مبناي تقاوت در جذب سطحي اجزاي فاز متحرک و فاز ساکن صورت مي گيرد. در کروماتوگرافي جذب سطحي، فاز متحرک مايع (حلالي مانند هگزان) و فاز ساکن جامد (مانند آلومين) است بنابراين نوع خاصي از کروماتوگرافي مايع – جامد محسوب مي شود.

در اين نوع جداسازي حلال(فاز متحرک) با عبور خود از ميان ستون جامد (فاز ساکن) اجزاي مخلوط را با خود حمل مي کند. سرعت حرکت هر جزء ، به ميزان جذب سطحي آن بر روي ماده داخل ستون بستگي دارد. به اين ترتيب سرعت ماده اي که کم جذب شده است بيشتر از ماده اي که زياد جذب شده است خواهد بود و اجزايي که قابليت جذب بالاتري دارند، در قسمت بالاي ستون و اجسامي که قابليت جذب کمتر دارند در قسمت هاي پايين ستون ، جذب خواهند شد. حال اگر اختلاف بين جذب هاي سطحي به حد کافي زياد باشد، جداسازي مواد کامل انجام خواهد گرفت..

▪ کروماتوگرافي لايه نازک

اين نوع کروماتوگرافي نمونه اي از کروماتوگرافي جذب سطحي است که در آن، به جاي اينکه ستون ها از جاذب پر شوند، آن را به صورت لايه نازک روي يک صفحه شيشه اي يا لايه پلاستيکي يا ورقه فلزي قرار مي دهند. ساير اصول جداسازي مانند روش کروماتوگرافي جذب سطحي است.

▪ کروماتوگرافي تبادل يوني

در اين روش بين فاز متحرک (محلول) و فاز ساکن (جامد) به صورت برگشت پذير يون مبادله مي شود. جامد تشکيل دهنده فاز ساکن رزين ناميده مي شود و پايداري مکانيکي و شيميايي و يکنواختي اندازه ذرات از خصوصيات آن ها است. قالب اين رزين ها بر پايه يک بسپار بزرگ (معمولا پلي استيرن) استوار است اما برخي از آن ها متکي بر اسيد متا اکريليک هستند، رزين ها به دو نوع تعويض کننده آنيوني و کاتيوني تقسيم مي شوند. هر کدام از اين تعويض کننده ها به نوع بازي ضعيف و قوي و اسيدي ضعيف و قوي تقسيم مي شوند. مي توان اين روش را مانندکروماتوگرافي جذبي در نظر گرفت به گونه اي که رزين ها جايگزين جاذب شده باشند. رزين ها بايد داراي گروه هاي مبادله کننده تک عاملي باشند و درجه اتصالات عرضي کنترل شده داشته باشند. گستره اندازه ذرات نيز بايد تا آنجا که ممکن است کوچک باشد. با اين روش کروماتوگرافيمي توان محلول هاي رقيق را به خوبي جداسازي کرد.

▪ کروماتوگرافي ژلي

اين نوع کروماتوگرافي براي اولين بار در سال ۱۹۵۴ معرفي و در سال ۱۹۵۹ اصلاح شد. در اينروش جداسازي هاي مبتني بر الک کردن مولکولي بر روي اجسام بي بار در جريان مهاجرت الکترو اسمزي از داخل ژل ها انجام مي شود. بدين ترتيب که جداسازي بر مبناي اندازه هاي نسبي مولکول ها انجام شده و از اصطلاح صاف کردن به وسيله ژل استفاده مي شود. ژل استفاده شده در اين روش بايد بي اثر و پايدار باشد. فاز ساکن از يک قالب متخلخل تشکيل شده که منفذهاي آن به وسيله حلالي که فاز متحرک را تشکيل داده پر شده است. از آنجا که اساس جداسازي بر اين است که مولکول هاي بزرگ تر از حد وارد سوراخ ها نشده و به ترتيب جرم مولکولي از ستون خارج شوند و مولکول هاي کوچک تر بر حسب شدت نفوذشان سوراخ ها را پر کنند پس اندازه سوراخ بسيار مهم است. همچنين گرانروي نمونه نيز اهميت زيادي دارد و نبايد از دو برابر گرانروي شوينده بيشتر باشد. از ديگر عوامل مهم حجم نمونه است بدين ترتيب که هر چه حجم نمونه کمتر باشد، غلظت هر جزء در محلول خارج شده نيز کمتر خواهد بود.

▪ کروماتوگرافي تقسيمي

در اين روش که نمونه اي از کروماتوگرافي مايع مايع است، شيوه کار بسيار شبيه بهکروماتوگرافي جذب سطحي است و تفاوت اين دو روش در ماهيت ماده پر شده در ستون است. همچنين حجم ظرفيت يک ستون تقسيمي، غالبا کوچک تر از ظرفيت يک ستون جذب سطحي بوده و گاهي اين اختلاف خيلي زياد است. فاز ثابت لايه اي از محلول است که روي سطح جامد ناصافي مانند سيليکاژل قرار دارد و فاز متحرک مايعي غير محلول در مايع اولي است. سرعت حرکت يک جزء از مخلوط تابع انحلال پذيري آن در فاز ساکن است يعني جدا شدن اجزا بدين صورت است که اجسامي که بيشتر حل مي شوند، کندتر از اجسامي که کمتر حل مي شوند به طرف پايين ستون حرکت مي کنند. در جريان عبور از ستون ، اجسام ميان دو فاز تقسيم شده و جداسازي انجام مي شود. در اين روش ابتدا مخلوط اجسام به صورت يک نوار در ستون در مي آيد که علت آن جذب سطحي يا جذب به وسيله فاز ساکن است. و سپس از روش هاي ديگري براي جداسازي مواد استفاده مي شود.

▪ کروماتوگرافي کاغذي

کروماتوگرافي کاغذي نوع خاصي از کروماتوگرافي تقسيمي است که در آن صفحات کاغذي جاي ستون پر شده را مي گيرند. در اين روش فاز ساکن آب است و به وسيله جذب سطحي بر روي مولکول هاي سلولز قرار مي گيرد. مولکول هاي سلولز نيز به نوبه خود به وسيله ساختار اليافي کاغذ در وضعيت هاي ثابت نگه داشته مي شود. در ابتدا کروماتوگرافي کاغذي براي جداسازي مخلوط هاي مواد آلي به کار مي رفت. اما امروزه براي جداسازي يون هاي معدني استفاده مي شود. به وسيله اين روش هم آنيون ها و هم کاتيون ها را مي توان جداسازي کرد.

براي انجام اين روش قطره اي از محلول حاوي مخلوطي که بايد جدا شود را روي يک صفحه يا نوار کاغذ صافي در محل علامت گذاري شده قرار مي دهند. قطره به صورت يک لکه حلقوي در اين محل پخش مي شود. هنگامي که لکه خشک شده کاغذ را در يک ظرف مناسب سربسته طوري قرار مي دهند که يک سر آن در حلال انتخاب شده به عنوان فاز متحرک فرو رود، حلال از طريق الياف کاغذ در نتيجه عمل موئينگي نفوذ مي کند. پس از گذشت زمان از قبل تعيين شده، وقتي حلال مسافت مناسبي را طي کرد، کاغذ را بيرون آورده و حلال را با علامتي مشخص مي کنند. پس از خشک شدن صفحه وقتي محل هاي مناطق جدا شده آشکار شدند هر يک از اجسام به طور جداگانه شناسايي مي شوند. در موارد ايده آل ، هر جسم با واکنش گر مکان ياب ، رنگ مخصوصي مي دهد که در مورد مواد معدني بيشتر و درمورد مواد آلي کمتر مشاهده مي شود. ساده ترين روششناسايي بر اساس مقدار Rf يعني نسبت فاصله طي شده به وسيله جبهه حلال است.

از نقايص کروماتوگرافي کاغذي مي توان به مواردي چون لکه هاي چند تايي ، دنباله دار شدن و اثرات لبه يا کناره اشاره کرد. اين روش در جداسازي مواد با ماهيت زيستي وسيع ترين کاربرد را داشته و در مسائل کلينيکي و زيست شيميايي ، جداسازي اسيدهاي آمينه و پپتيدها در بررسي ساختارهاي پروتئين به کار گرفته مي شود. آزمايش روزمره ادرار و ساير مايعات بدن براي اسيد آمينه و قند، جداسازي بازهاي پورين و نوکلئوتيدها در آزمايش اسيدهاي نوکلئيک، جداسازي استرئيدها، تجزيه عمومي، تجزيه بسپارها، تشخيص و ارزيابي فلزات در خاک ها و نمونه هاي زمين شناسي، بررسي ترکيبات فنلي در عصاره هاي گياهي، جداسازي آلکالوئيدها و جداسازي ترکيبات علامت دار به وسيله راديو ايزوتوپ ها از ديگر کاربردهاي کروماتوگرافي کاغذي است، البته توجه داشته باشيد که براي جداسازي مواد فرار غير فعال مانند هيدروکربن ها و ديگري جداسازي اسيدهاي چرب با فراريت بيشتر اين روش مناسب نيست.

▪ کروماتوگرافي ستون مويين

در اين روش که نوعي از کروماتوگرافي گاز مايع محسوب مي شود، لوله مويين بلندي وجود دارد که لايه نازکي از فاز ساکن داخل آن را پوشانده است. قدرت جداسازي ستون هاي مويين پنج برابر ستون هاي معمولي است و زمان جداسازي مواد در اين روش کمتر است. همچنين از يک آشکارساز کوچک و حساس و يک تقسيم کننده خطي تشکيل شده تا عواملي چون تغييرات دما، سرعت عبور، اندازه نمونه و نسبت تقسيم تاثيري بر آن نداشته باشد. از آنجا که سرعت خارج شدن اجزاي جدا شده بسيار بالا است، آشکارساز بايد زمان پاسخ سريعي داشته باشد. البته ثبات هاي معمولي پتانسيل سنجي قادر به همگامي با علائم حاصل از آشکارساز نبوده و بايد از دستگاه ديگري مانند يک نوسان کننده اشعه کاتد براي نمايش علائم مي توان استفاده کرد.

 

منابع : 
----------------------
ماهنامه تخصصي مهندسي پزشکي ( www.iranbmemag.com )