کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا به‌عنوان یک تکنیک ویژه شناخته می‌شود. این روش برای جداسازی، شناسایی و اندازه‌گیری کمی ترکیبات در مخلوط‌ها کاربرد دارد. اصول HPLC بر اساس پمپاژ حلال مایع با فشار بالا به داخل دستگاه و عبور مخلوط نمونه‌ها از ستون پر شده با مواد جاذب جامد است. هر نمونه با فاز ساکن ستون برهم‌کنش می‌دهد و تعادلات مداوم بین فاز متحرک و فاز ساکن شکل می‌گیرد.

نمونه‌هایی که تمایل بیشتری به فاز ساکن دارند، دیرتر از ستون خارج می‌شوند. در نتیجه نمونه‌هایی که ابتدا مخلوط هستند، در انتهای ستون به‌صورت جداگانه جمع‌آوری می‌شوند.

نحوه انجام HPLC

نمونه‌ها در حجم‌های پایین (چند میکرولیتر) وارد دستگاه می‌شوند. سپس به فاز متحرک ملحق می‌شوند و از ستون عبور می‌کنند. اجزاء نمونه با سرعت‌های متفاوت حرکت می‌کنند که به ویژگی‌های شیمیایی و برهم‌کنش‌های فیزیکی فاز متحرک و فاز ساکن بستگی دارد. زمانی که نمونه‌ها از ستون عبور می‌کنند، به آن «زمان ماند» گفته می‌شود.

انواع کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا

۱. HPLC با فاز نرمال
در این روش، نمونه‌ها بر اساس تمایلشان به فاز قطبی (مثل سیلیکا) جدا می‌شوند. فاز متحرک غیر قطبی است. نمونه‌های قطبی بیشتر با فاز ساکن برهم‌کنش دارند و زمان ماند طولانی‌تری دارند. افزودن حلال کمی قطبی به فاز متحرک، زمان ماند نمونه‌ها را کاهش می‌دهد.

۲. HPLC با فاز معکوس
این روش برعکس HPLC فاز نرمال است. فاز ساکن غیر قطبی و فاز متحرک نسبتا قطبی یا آبی است. نمونه‌های با قطبیت کمتر زمان ماند بیشتری دارند. افزودن مقدار کمی آب به فاز متحرک، زمان ماند نمونه‌ها را کنترل می‌کند.

۳. کروماتوگرافی اندازه‌ای (Gel Filtration / Size Exclusion)
در این روش جداسازی بر اساس اندازه مولکولی انجام می‌شود. مولکول‌های بزرگتر از حفره‌های فاز ساکن عبور می‌کنند و سریع‌تر خارج می‌شوند. مولکول‌های کوچک‌تر، زمان ماند بیشتری دارند.

۴. کروماتوگرافی تبادل یونی
این روش بر اساس برهم‌کنش یون‌های محلول با بارهای سطح فاز ساکن عمل می‌کند. یون‌های هم‌بار با فاز ساکن طرد می‌شوند و یون‌های مخالف، در ستون باقی می‌مانند. تغییر قدرت یونی فاز متحرک، دما یا pH، موجب خروج این یون‌ها می‌شود.

دتکتورهای HPLC

دتکتورها به دو دسته تقسیم می‌شوند:

• عمومی: کل خروجی را بررسی می‌کنند، مثلا با اندازه‌گیری ضریب شکست فاز متحرک.
• انتخابی: ویژگی خاصی از آنالیت مانند جذب UV-Vis را اندازه‌گیری می‌کنند.

دتکتورهای پرکاربرد:

• UV-Vis
• فلوئورسانس
• Charged Aerosol Detector
• Mass

امکان استفاده از دتکتور ترکیبی نیز وجود دارد، مانند UV-Vis-Mass یا چند دتکتور Mass پشت سر هم.

خدمات فنی و مهندسی طیف‌سنج کیمیا آماده ارائه تعمیر و سرویس دستگاه‌های HPLC می‌باشد.