اصول اولیه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)
کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا یا High-Performance Liquid Chromatography یکی از مهمترین و دقیقترین روشهای جداسازی در شیمی تجزیه است که برای تفکیک، شناسایی و اندازهگیری کمی ترکیبات در مخلوطها کاربرد دارد.
پایه عملکرد HPLC بر عبور فاز متحرک مایع تحت فشار بالا از درون ستونی شامل فاز ساکن جامد بنا شده است. مولکولهای نمونه در طول عبور از ستون، بسته به میزان تمایلشان به فاز ساکن یا فاز متحرک، با سرعتهای متفاوت حرکت میکنند. این تفاوت سرعت، همان اصل کلیدی در جداسازی کروماتوگرافی است.
نحوه عملکرد کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا
در HPLC، نمونه معمولاً در حجمهای بسیار کم (۱ تا ۲۰ میکرولیتر) به سیستم تزریق میشود. جریان فاز متحرک به کمک پمپهای فشار بالا (نهایتاً تا حدود ۶۰۰–۱۰۰۰ بار بسته به مدل دستگاه) وارد ستون شده و ترکیبات را با خود حمل میکند.
هر مولکول بسته به موارد زیر رفتار متفاوتی در ستون دارد:
- قطبیت
- اندازه مولکولی
- بار الکتریکی
- قدرت برهمکنش با فاز ساکن
وقتی ترکیب از ستون خارج میشود، بهوسیله دتکتور آشکارسازی شده و زمان خروج آن به صورت زمان ماند (Retention Time) ثبت میگردد. اختلاف زمان ماند میان ترکیبات مختلف، پایه جداسازی است.
انواع کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا
۱. کروماتوگرافی مایع فاز نرمال (Normal Phase HPLC)
در این روش:
- فاز ساکن قطبی (معمولاً سیلیکا)
- فاز متحرک غیرقطبی (هگزان، کلروفرم و …)
جداسازی بر اساس قطبیت انجام میشود؛ ترکیبات قطبی دیرتر و ترکیبات غیرقطبی زودتر خارج میشوند. این روش برای جداسازی ایزومرها و مولکولهای با قطبیت بالا کاربرد دارد.
نکته علمی بهروز:
طبق منابع Agilent، وجود مقادیر بسیار کم آب در فاز متحرک، باعث آبپوشی سطح سیلیکا و کاهش زمان ماند میشود.
۲. کروماتوگرافی مایع با فاز معکوس (Reverse Phase HPLC – RP-HPLC)
رایجترین نوع HPLC در جهان.
در این روش:
- فاز ساکن غیرقطبی (C8، C18)
- فاز متحرک قطبی (آب، متانول، استونیتریل)
در RP-HPLC، ترکیبات کمقطب بیشتر روی ستون نگه داشته میشوند و دیرتر خارج میگردند.
افزایش درصد آب در فاز متحرک ⇐ افزایش زمان ماند ترکیبات هیدروفوب.
کاربرد: دارویی، زیستی، غذایی، سمشناسی، محیط زیست.
۳. کروماتوگرافی ژل تراوایی یا طرد اندازه (Size Exclusion Chromatography – SEC/GPC)
در این روش جداسازی بر اساس اندازه و وزن مولکولی است.
- مولکولهای بزرگ ⇐ورود کمتر به حفرات ستون ⇐ خروج سریعتر
- مولکولهای کوچک ⇐ ورود بیشتر ⇐ زمان ماند longer
کاربرد:
پلیمرها، پروتئینها، کنترل خلوص، توزیع وزن مولکولی.
۴. کروماتوگرافی مایع تبادل یونی (Ion Exchange Chromatography – IEC)
بر اساس برهمکنش الکترواستاتیک بین یونهای محلول و گروههای باردار روی فاز ساکن.
- یونهای همبار ⇐ طرد میشوند
- یونهای با بار مخالف ⇐ روی ستون جذب شده و دیرتر خارج میشوند
با تغییر موارد زیر امکان شستشوی ترکیبات فراهم میشود:
- قدرت یونی فاز متحرک (افزودن نمک)
- pH
- دما
کاربرد: پروتئینها، اسیدهای آمینه، نوکلئوتیدها، یونهای معدنی.
دتکتورهای مورد استفاده در HPLC
دتکتورها به دو گروه تقسیم میشوند:
۱. دتکتورهای عمومی (Universal Detectors)
ویژگی کلی فاز متحرک یا نمونه را اندازه میگیرند:
- ضریب شکست (RID)
- EVAP/ELSD
۲. دتکتورهای انتخابپذیر (Selective Detectors)
تنها یک خصوصیت مشخص از آنالیت را ثبت میکنند:
- UV–Vis ⇐ رایجترین
- Fluorescence ⇐ بسیار حساس
- CAD (Charged Aerosol Detector)
- Mass Spectrometry (LC-MS)
رایجترین دتکتورها
- UV-Vis
- Fluorescence
- CAD
- Mass
- ترکیبی: UV–Vis–MS یا چند دتکتور Mass پشتسرهم
کاربردهای کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا
بر اساس منابع معتبر مانند FDA, USP, Agilent:
۱. بیوشیمی و علوم زیستی
- تحلیل پروتئینها، پپتیدها و اسیدهای آمینه
- شناسایی نوکلئوتیدها، نوکلئوزیدها
- سنجش متابولیتها
۲. صنایع دارویی
- آزمون خلوص
- آنالیز داروهای کورتیکواستروئیدی، ضدالتهاب، آنتیبیوتیکها
- کنترل کیفی (QC)
- مطالعات فارماکوکینتیک
۳. صنایع غذایی
- ویتامینها (A، D، E، B1، C)
- افزودنیها و نگهدارندهها
- عطر و طعمدهندهها
- آلایندهها مانند نیتروزآمینها و ملامین
۴. محیط زیست
- اندازهگیری هیدروکربنهای آروماتیک
- سموم کشاورزی در آب و خاک
- فنلها و آمینها
۵. صنایع شیمیایی
- الکلها، آلدئیدها، کتونها
- آنالیز اسیدهای چرب و استرها
- پایش فرآیندهای صنعتی
۶. دانشگاه و پژوهش
- آموزش عملی کروماتوگرافی
- تحقیقات دانشگاهی و صنعتی
معرفی دستگاه Agilent 1260 Infinity LC (بر اساس اسناد رسمی Agilent)
دستگاه Agilent 1260 Infinity LC یکی از معتبرترین و پرفروشترین دستگاههای HPLC جهان است و با بیش از ۱۰۰٬۰۰۰ دستگاه نصبشده در آزمایشگاهها، استاندارد طلایی HPLC بهشمار میرود.
ویژگیهای کلیدی
- کاربری ساده حتی برای کاربران تازهکار
- کارایی بالا و مناسب برای آنالیزهای روتین
- قابلیت استفاده در HPLC و UHPLC
- فشار عملیاتی تا ۶۰۰ بار
- دبی ۰٫۰۰۱ تا ۱۰ mL/min
- دتکتور DAD با نویز بسیار پایین (۰٫۶ μAU)
- سازگاری کامل با ستونهای Poroshell و ZORBAX
مزایا (طبق Agilent Technical Guide 2024)
- جریان پایدار بدون پالس
- تکرارپذیری عالی در زمان ماند و سطح پیک
- انعطافپذیری بالا در ارتقا (پمپ ایزوکراتیک → گرادیانی، اضافهکردن آون ستون، اتوسمپلر، دتکتورهای پیشرفته و …)
- قابلیت تبدیل آسان HPLC ⇔ UHPLC با استفاده از ستونهای زیر ۲ میکرون
نتیجهگیری
کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا یکی از قدرتمندترین تکنیکهای آنالیتیک برای جداسازی و تحلیل ترکیبات در صنایع مختلف از جمله داروسازی، محیط زیست، بیوشیمی و صنایع غذایی است. دقت بالا، تکرارپذیری عالی و قابلیت استفاده از انواع دتکتورها، این روش را به گزینهای ایدهآل برای تحلیلهای کمی و کیفی تبدیل کرده است.