اصول اولیه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا

کروماتوگرافی با کارایی بالا به عنوان یک تکنیک ناب و ویژه ای به شمار می رود که برای جداسازی، باز شناسایی و اندازه گیری کمی ترکیبات در مخلوط ها مورد کاربست آنالیزهای شیمیایی واقع می گردد. پایه های اولیه نحوه کارکرد کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا بر این روش استوار می باشد که حلال مایعی با فشار بالا به داخل کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا پمپ می گردد که این حلال مخلوطی از نمونه هاست و مخلوط از درون یک ستون عبور می نماید که با مواد جاذب جامد پر شده است. هر نمونه درون این حلال در حال عبور از درون ستون کروماتوگرافی – که به ترتیب به آن ها فاز متحرک و فاز ساکن اطلاق می گردد- با فاز ساکن و جامد درون ستون برهمکنش دارد و لحظه به لحظه تعادلاتی پی در پی بین فاز ساکن و فاز متحرک ایجاد می گردد. این تعادلات لحظه ای بر حسب تمایل بیشتر یا کمتر نمونه به فاز ساکن باعث دیرتر خارج شدن از ستون کروماتوگرافی با نمونه هایی می گردد که تمایل برهمکنش بیشتری با فاز ساکن دارند و این در مقایسه با نمونه هایی است که تمایل کمتری به این فاز دارند. در نتیجه نمونه هایی که در ابتدای ستون با هم مخلوط همگنی دارند، در انتهای ستون بصورت مجزا خارج می گردند.

نحوه انجام کروماتوگرافی با کارایی بالا

مخلوط نمونه هایی که برای جداسازی به محصولات کروماتوگرافی مایع اعمال می شوند، در حجم های پایین حدود چند میکرولیتر به دستگاه تزریق می شوند، سپس این مخلوط وارد یک فاز متحرک می شود و از درون ستون با همدیگر عبور می نمایند. اجزاء نمونه در طول ستون با سرعت های متفاوتی عبور می کنند. این سرعت خود وابسته به ویژگی های شیمیایی و برهمکنش های فیزیکی فاز متحرک و فاز ساکن می باشد. به زمانی که هر نمونه خاص از طول ستون می گذرد و در طرفی دیگر دیده می شود، زمان ماند هر نمونه اطلاق می گردد.

انواع کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا

• کروماتوگرافی مایع فاز نرمال

این تکنیک از اولین روش های مورد کاربست در کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا محسوب می شود. در این روش نمونه ها بر حسب تمایلشان به یک فاز قطبی مانند سیلیکا از هم جدا می شوند. علاوه بر آن توانایی نمونه ها به درگیر شدن در برهمکنش های قطبی مانند برهمکنش های پیوند های هیدروژنی یا برهمکنش های پیوند دوگانه با پیوند دوگانه از اهمیت بالایی برخوردار است. در این کروماتوگرافی فاز متحرک غیر قطبی و یا غیر آبی مورد استفاده واقع می گردد. درست مانند کلروفرم این روش نیز به طور مؤثر و قابل توجهی برای جداسازی نمونه هایی مناسب است که به راحتی در حلال های غیر قطبی حل می شوند. نمونه ها در فاز ساکن قطبی با یکدیگر درگیر هستند و آن نمونه ای بیشتر در این پروسه درگیر می گردد که قطبیت بیشتری را داشته باشد. قطبیت بیشتر به معنای جذب بیشتر می باشد. قدرت برهمکنش علاوه بر آنکه تابعی از گروههای عاملی موجود در ساختار مولکولی نمونه به شمار می آید، تابعی از فاکتور استری نیز هست. فاکتور استری امکان جداسازی ایزومرهای ساختاری را به کاربر اعطاء می کند.

بهره جستن از حلال های کمی قطبی تر در فاز متحرک، باعث زمان کمتر ماند نمونه در ستون می گردد. چرا که نمونه غیر قطبی با دو فاز قطبی تر کمتر برهمکنش از خود به نمایش می گذارد. برخورداری مقدار بسیار کمی از آب در فاز متحرک سبب آب پوشی سطح فاز ساکن می شود که در نتیجه کاهش بیشتر زمان ماند نمونه را در پی دارد.

• کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا با فاز معکوس

این روش شامل: یک فاز ساکن غیر قطبی و یک فاز متحرک آبی یا نسبتا قطبی می باشد که دقیقا برعکس کروماتوگرافی مایع با فاز نرمال می باشد. از معمول ترین فاز های ساکن مورد استفاده در این روش، سیلیکایی می باشد که سطح آن به وسیله گروه های دارای شاخه های کربنی بین 8 تا 18 کربن اصلاح گشته است. این گروههای عاملی سطحی بصورت RMe2SiCl مشخص می شوند که  R نشان دهنده شاخه های کربنی دارای 8 تا 18 کربن است. با استفاده از این فاز ساکن، زمان ماند نمونه در ستون برای نمونه هایی با قطبیت کمتر، بیشتر خواهد شد و با تغییر در میزان قطبیت فاز متحرک نظیر افزودن مقدار کمی آب به این فاز می توان زمان ماند نمونه را درون ستون بیشتر کرد.

•   کروماتوگرافی مایع بر اساس اندازه نمونه (کروماتوگرافی طردی)

این روش کروماتوگرافی نیز به روش کروماتوگرافی ژل تراوایی یا فیلتر کردن ژلی معروف گشته است که از دیگر تکنیک های کروماتوگرافی HPLC به شمار می آید. روش جدا سازی نمونه ها در این روش بر حسب سایز و اندازه مولکولی آنان صورت می گیرد. این تکنیک رزولوشن پایینی دارد و غالبا در گام پایانی در مرحله خالص سازی مورد استفاده قرار می گیرد. از نکات دیگر در این روش اینکه مولکول های بزرگتر که توانایی ورود به حفره های فاز ساکن را ندارند، از درون ستون عبور می کنند ولی مولکول های ریزتر که داخل حفرات دسته و پنجه نرم می کنند، دیرتر از ستون عبور خواهند کرد. پس می توان نتیجه گرفت که مولکول های ریزتر زمان ماند بیشتری را در ستون می گذرانند.

•   کروماتوگرافی مایع تبادل یونی

کروماتوگرافی مایع تبادل یونی از دیگر روش های کروماتوگرافی HPLC می باشد که نحوه جداسازی در این روش بر اساس برهمکنش و جذب یونهای موجود در حلال و بارهای مستقر در سطح فاز ساکن صورت می گیرد. یونهای محلول که باری مشابه با فاز ساکن دارند، طرد می شوند. این در حالی است که یونهایی که بار مخالف با بار سطح فاز ساکن دارند، در ستون همچنان باقی می مانند. این یونها با استفاده از تغییر وضعیت فاز متحرک به راحتی از داخل ستون خارج خواهند شد. تغییر وضعیت ممکن است با افزایش قدرت یونی فاز متحرک انجام شود که به کمک افزودن نمک به حلال صورت می گیرد. همچنین ممکن است با افزایش دمای ستون و یا تغییر pH محلول و نیز روش های دیگر انجام شود.

روش های دیگری نیز در کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا وجود دارد که از آن ها صرف نظر کرده و فقط به ذکر پرکاربرد ترین روش های آن پرداختیم.

انواع دتکتورهای مورد استفاده در HPLC

دتکتورهای کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا به طور کلی به دو دسته اصلی تقسیم پذیر هستند:  دتکتورهای عمومی و  دتکتور های انتخابی.

دتکتورهای  عمومی غالبا توده و کل خروجی را با ارزیابی تفاوت میان آن ها در خصوصیات فیزیکی فاز متحرک مانند ضریب شکست مورد بررسی و واکاوی قرار می دهند. این در حالی است که در دتکتورهای انتخابگر، فقط یک ویژگی خاص از آنالیت اندازه گیری می شود. مانند جذب نور ماوراء بنفش یا مرئی که در اینجا یکی از ویژگی های فیزیکی یا شیمیایی از آنالیت مورد واکاوی قرار می گیرد.

پرکاربردترین دتکتورهای کروماتوگرافی

• دتکتور UV-Vis

• دتکتور فلوئورسانس

• دتکتور charged aerosol detector

• دتکتور mass

البته امکان استفاده از دتکتور های ترکیبی نیز وجود دارد. مانند: UV-Vis-mass و یا استفاده از چند دتکتور Mass پشت سر هم نیز امکان پذیر است.

خدمات فنی و مهندسی نانو ابزار، آماده هر گونه خدماتی وابسته به تعمیرکروماتوگرافی مایع با کارایی بالا می باشد.